Владивостокский Государственный Медицинский Университет

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

РЕФЕРАТ

Диагностика стафилококковых инфекций

Выполнил: Новак А.Л.

301 гр., л/ф

Владивосток, 1998.

Предисловие

Несмотря на то, что стафилококки принадлежат к числу наиболее легко обнаруживаемых и распознаваемых микроорганизмов, не требующих сложных диагностических приемов для их выявления, в практической работе микробиологи до сих пор испытывают определенные трудности при установлении их причинной роли в ряде различных заболеваний. С одной стороны, присутствие патогенных стафилококков, обнаруживаемое в исследуемом материале, не всегда является убедительным доказательством их этиологического значения. С другой, учитывая большое разнообразие проявлений биологической активности этих микробов, зависящее от разных, не всегда поддающихся учету факторов, широкую их изменчивость под влиянием лекарственных веществ и самого макроорганизма, довольно сложно бывает определить их потенциальную патогенность. Наконец, третья причина связана с тем, что стафилококки являются представителями нормальной микрофлоры из группы условно патогенных микроорганизмов и, наряду с непатогенными, патогенные представители обитают в организме людей, распространяясь при этом весьма неравномерно на разные участки человеческого тела.

Если выделение патогенного стафилококка, из крови больных людей и различных полостей, которые принято считать стерильными, в подавляющем большинстве случаев может служить доказательством его роли как возбудителя болезни, то присутствие стафилококков на слизистых зева, носа и т. д. даже при явном болезненном состоянии их требует большой осторожности исследователя в выводах об этиологии данных заболеваний.

Поэтому, естественно, не может быть общих рекомендаций, как при диагностике различных стафилококковых инфекций, так и при микробиологических исследованиях участков тела человека и разных объектов внешней среды. Широкий обмен мнениями между микробиологами научных учреждений и практических лабораторий, осуществляемый на съездах и конференциях, посвященных проблемам стафилококковых инфекций, а также при личных контактах, казалось бы, должен был привести к определенным взглядам на различные методы исследования, предлагаемые для выделения и идентификации стафилококков. Однако большое число запросов, поступающих из лабораторий СЭС и лечебных учреждений, свидетельствует о явных затруднениях, которые возникают у исследователей при решении разных вопросов микробиологической диагностики стафилококков, а в ряде микробиологических учреждений бытуют еще некоторые устаревшие методы и приемы, приводящие к неправильным оценкам и даже досадным недоразумениям.

Важным условием эффективности лабораторной диагностики является сочетанное определение качественных и количественных критериев содержания патогенных стафилококков в исследуемом материале. Исходя из этого, я считаю необходимым изложить ряд методов основных микробиологических исследований, наиболее простых и доступных для каждой практической и научной лаборатории, которыми мы пользуемся в течение многих лет.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ

Предварительная диагностика стафилококков может основываться на бактериоскопическом изучении препаратов — мазков, окрашенных по Граму.
Патогенные стафилококки, помимо гроздевидного расположения, характеризуются правильной сферической формой клеток. Обнаружение стафилококков, находящихся внутри клеток, позволяет дать ответ о наличии стафилококковой инфекции. В большинстве же случаев для точного установления патогенности обнаруженных стафилококков требуется выделить эти микроорганизмы в чистой культуре путем посева исследуемого материала на плотные питательные среды.

В настоящее время ассортимент дифференциальных, элективных и накопительных сред, предложенных для выделения патогенных стафилококков, весьма значителен и продолжает расширяться. Многие исследователи на основе знания основных биохимических характеристик и питательных потребностей патогенных стафилококков при конструировании сред стремятся повысить их высеваемость и обеспечить возможность осуществлять их количественный учет, получить надежный способ отличать потенциально болезнетворные стафилококки от сапрофитов.

Употребление жидких накопительных сред для первичного выделения стафилококков нецелесообразно, так как лишает исследователя возможности количественной оценки содержания микробов в обследуемых объектах, а при случайных загрязнениях способствует ошибкам. Особенно это относится к таким исследованиям, как обнаружение носительства патогенных стафилококков, где доказательством является лишь массивный рост, либо определение этиологической роли этих микроорганизмов "при пищевых отравлениях или наружных воспалительных процессах. Если же речь идет об исследовании крови, а также о тех немногих случаях, когда бывает необходимо выявить даже единичные жизнеспособные особи этих микробов, например при контроле эффективности дезинфекции, проверке на стерильность или титрационных посевах, то в подобных случаях использование накопительных сред вполне оправдано.

Из большого числа разнообразных питательных сред, опробованных для первичного выделения стафилококков, в практике оправдал,;1' себя немногие.
Обычный питательный агар (рН 7,2 7,4), приготовленный путем добавления 2% агар-агара к мясопептонному бульону или к триптическому перевару
Хоттингера, может быть использован при исследовании экссудатов из закрытых полостей. Стафилококки вырастают через 18—24 ч инкубации при 37° С в виде гладких блестящих с ровными краями непрозрачных и слегка выпуклых колоний.
Характер пигмента выявляется лучше после дополнительного суточного выдерживания чашек при комнатной температуре (20° С) на свету. Если в исследуемом материале присутствует посторонняя флора, то по внешнему виду колонии стафилококков могут быть трудно отличимы.

Употребление кровяного агара дает возможность, кроме выявления пигмента, определить и гемолитическую активность стафилококков. При этом необходимо помнить, что гемолитическая способность, определяемая на чашках с кровяным агаром, зависит от многих факторов — вида крови, ее концентрации, наличия в ней антитоксинов, толщины слоя среды, содержания углекислого газа в атмосфере культивирования, густоты посева, присутствия и характера сопутствующей флоры и т. д.

При отборе колоний с кровяного агара необходимо отвивать как гемолитические, так и не дающие гемолиза, особенно если исследование проводится на среде с человеческой или лошадиной кровью, а отсутствие гемолиза на таких средах не позволяет заключить об отсутствии вообще гемолитической активности. Поэтому использование кровяного агара для первичного посева целесообразно только при обследовании объектов, не содержащих посторонней микрофлоры, и желательно добавлять в питательную среду кровь кролика или барана.

Если же проводится исследование гноя открытых ран или отделяемого язв или свищей, то следует пользоваться элективно-дифференциальной средой для стафилококков — желточно-солевым агаром (ЖСА) Г. Н. Чистовича.
Элективность этой среды обеспечивается высоким содержанием хлористого натрия, а добавленный яичный желток позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков и в силу этого ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар. Приготовление ЖСА несложно.

Заготовляют впрок и стерилизуют в автоклаве при 120 °С" в течение 20 мин питательный агар (МПА или Хоттингера) рН 7,2—7,4, содержащий 10% поваренной соли. Перед употреблением солевой питательный агар растапливают, остужают до 45—50 °С и добавляют к нему 20% по объему стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 200 мл физиологического раствора). Для лучшего эмульсирования желательно иметь колбы со стеклянными бусами. После тщательного перемешивания среду разливают по 20—25 мл в чашки, которые могут храниться в холодильнике в течение нескольких дней.

Следует производить массивный посев исследуемого материала на чашки с
ЖСА, а инкубацию вести в течение 2 суток при 35—37° С. Посторонняя флора резко подавляется, стафилококки же на ЖСА вырастают практически в чистой культуре. Непосредственно при просмотре чашек вокруг колоний отмечается образование радужных венчиков и мутной зоны — лецитовителлазная реакция.
Такие колонии, не менее двух из каждого посева, отвивают на скошенный мясо- пептонный агар для последующей проверки выросших культур в реакции плазмо- коагуляции.

Чтобы избежать ошибок в определении желточной реакции, необходимо иметь в виду, что иногда наблюдается помутнение среды без радужного ободка, в этом случае проба на лецитовителлазу считается отрицательной. Если же колонии, выросшие на ЖСА, не дают лецитовителлазной реакции, т. е. не окружены радужным венчиком, но имеется рост стафилококков, то их тоже считают подозрительными и также отвивают не менее двух из каждого такого посева на чашки с простым питательным агаром пятнами диаметром 5—10 мм.
После суточного инкубирования при 37° С полученные макроколонии проверяют в реакции плазмоагглютинации, для чего микробную массу размешивают петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1
:4. Образование хлопьев учитывают в течение 30с—1 мин. При наличии плазмоагглютинации такие штаммы считают подозрительными и отвивают на скошенный агар для дальнейшего изучения в коагулазной реакции. При таком отборе число пропускаемых штаммов патогенных стафилококков человеческого происхождения невелико, культуры же, выделенные от животных, требуется проверять в реакции плазмокоагуляции.

Коагулазная проба является основным признаком, определяющим болезнетворность стафилококков, поэтому ее постановка требует к себе максимального внимания. Для выявления коагулазной активности у стафилококков, выделенных от людей, можно пользоваться как цельной кровью, так и плазмой кроликов или человека. Можно использовать также кровь или плазму, взятую непосредственно от человека. Консервированная плазма или кровь, используемые для переливания, непригодны для реакции, так как к ним часто добавляются консерванты, которые препятствуют жизнедеятельности стафилококков, проявлению коагулазной активности. Не следует применять кровь животных или людей, переносящих стафилококковые заболевания, в особенности затяжные, так как она может оказаться нестерильной и содержать антикоагулазу. При работе со стафилококками, выделенными от рогатого скота, можно пользоваться бычьей кровью.

Асептично взятую кровь стабилизируют с помощью 1—4% цитрата или 0,1% оксалата. Для получения плазмы нитратную кровь центрифугируют или отстаивают на холоду. Но, как уже говорилось, можно пользоваться и цельной кровью. Затем кровь разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1 : 3 или 1 : 5 и разливают по 0,2—0,3 мл в стерильные пробирки, которые перед стерилизацией должны быть тщательно вымыты, так как остатки химических веществ могут влиять на результат плазмокоагуляции.

Поделитесь этой записью или добавьте в закладки