Структура грамицидинового канала, его фундаментальное и практическое значение

Категория реферата: Остальные рефераты
Теги реферата: реферат на тему пушкин, решебник по математике виленкин
Добавил(а) на сайт: Яковцов.

Название (-спираль, предложенное вначале для описания конформаций грамицидина было не совсем корректным, так как это название обычно используется для 4,416-спиралей, имеющих типичную ориентацию водородных связей ( все амидные группы пептидного остова в данной структуре обращены в оддну сторону, что в результате дает сильный суммарный диполь) , в то время как спирали предложенные для грамицидина не имеют такую геометрию
(аминогруппы пептидного остова имеют различное направление, не образуя, таким образом, диполь). Ко всему прочему значения углов ( и (, расчитанные для данных структур, отличаются от таковых в (-спиралях описанных
Рамачандраном и Рамакришнаном [14]. Таким образом предложили называть такие структуры (-спиралями, что лучшим образом определяет образование водородных связей.

Не смотря на явные различия двух предложенных структур, спиральные димеры
((-спирали) и двухспиральные димеры (((спирали) имеют много общего и могут образовывать структуры почти идентичных размеров, и, более того, способ образования водородных связей одинаков в обоих случаях. Первичная последовательность грамицидина не делает жестких ограничений для направления закручивания спиралей, и они могут быть как право- , так и левозакрученными. Этот потенциальный полиморфизм связан с тем, что чередование L- и D-аминокислот не накладывает жестких ограничений на направление закрутки спирали. Так же, в обоих типах предложенных структур, боковые цепи аминокислон располагаются с наружней стороны спирали и ни одной боковой цепи нет во внутренней полости. В результате внутренняя полость (пора ) данных спиралей намного больше таковой для (-спиралей. Это связанно с природой ?-слоя: в последовательностях имеющих только L- аминокислоты, при образовании (-слоя боковые цепи обращены поочередно в разные стороны от плоскости слоя, а в случае чередования L- и D-аминокислот все боковые радикалы будут обращены в одну сторону от плоскости ?-слоя и , таким образом при сворачивании такой структуры в спираль они все окажутся снаружи, а внутри образуется пора , выстланная карбонильными группами пептидных связей, способная пропускать воду и ионы.

2.3.Конформация грамицидина А в растворе

Грамицидин принимает несколько типов конформаций в органических растворителях. Витч и сотр. [10, 15, 16] обнаружили, что диоксане грамицидин существует в виде 4-х различных форм, переходящих друг в друга и находящихся в медленном равновесии (время перехода одной формы в другую измеряется часами). Все четыре формы были разделены методом тонкослойной хроматографии, при чем каждая отдельная форма, выделенная с тонкослойной пластинки и нанесенная заново, опять проявлялась в виде четырех пятен.
Различные формы не показали различий в первичной структуре. Данные осмометрии и флуресценции [16], показали, что каждая из четурех форм является димером. Методом ИК-спектроскопии [10] было показанно, что все формы являются двойными спиралями, при чем формы 1,2 и 4 ( пронумерованны согласно их хроматографической подвижноси) являются параллельными двойными спиралями, а форма 3 – антипараллельной двойной спиралью [10]. Каждый из видов имеет характерный КД-спектр, дающий информацию о направлении закручивания спирали. Так как спектры видов 1 и 2 имеют одинаковую форму,
Витч и сотр. предложили, что они имеют одинаковое направление закручивания
[10]. Формы 1,2 и 3 имеют отрицательную эллиптичность в области 205-240 нм, направление закручивания спиралей является противоположной по сравнению с видом 4, форма спектра которого представляет собой зеркальное отображение видов 1,2 и 3.
Спектр грамицидина, полученный сразу после растворения кристаллов представляет собой спектр формы 3 [10]. Спектр равновесной смеси форм представляет собой наложение спектров отдельных форм, но за счет того, что спектры 1,2 и 4 практически взаимовычитают друг друга, он имеет форму вида
3 , даже если она находиться в незначительном количестве по отношению к другим.
КД спектроскопия не дает детальной информации о конформации каждой структуры, из-за того, что ( и ( углы в (-спиралях отличаются от таковых в
(-спиралях, (-слоях и (-поворотах, что делает сравнение данных спектров со спектрами других белков не эффективным.
Эти структуры были подтвержденны методом двумерного ЯМР [18], и показали что грамицидин в этаноле так же существует в виде 4-х взаимопревращаемых конформаций . Виды 1 и 2 являются левозакрученными параллельными двойными спиралями с 5,6 аминокислотного остатка на виток. Они отличаются взаимным расположением цепей и имеют одинаковый шаг спирали и высоту. Вид 2 имеет менее упорядоченные концы спирали обусловленные сдвигом на три аминокислотных остатка [17].
Вид 4 представляет из себя правозакрученной параллельной двойной спиралью, с таким же взаимным расположением цепей и высотой спирали что и вид 1 (это обуславливает форму его спектра КД, являющуюся зеркальным отображением видов 1 и 2).
Вид 3 (форма, образующаяся сразу после растворения кристаллов грамицидина) является левозакрученной антипараллельной двойной спиральюс 5,6 остатка на виток и сдвигом на три аминокислотных остатка. Эта форма является наиболее термодинамически выгодной в кристаллическом состоянии (рис.2) [19].
Рисунок 2. СРК Изображение левозакрученного антипараллельного двухспирального димера грамицидина с 5,6 остатка на виток (PDB Code:
1ALX). А – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.

Все описанные спирали стабилизирются 28-ю межмолекулярными водородными связями, не имеют внутримолекулярных водородных связей и совпадают с модельными , предложенными Витчом и сотр [10].
Грамицидин образует такую же смесь конформаций в различных спиртах, этилацетате [6] , и, хотя, время взаимоперехода в этих растворителях меньше

[20] , множественность структур все же удается зарегестрировать методом ЯМР
[18].
Исследования грамицидина в растворе DMSO показали, что он находится в виде мономера, и обнаруживается в виде одного пятна на тонкослойной пластинке
[16] . Методом ЯМР было показано, что в DMSO грамицидин находится в быстром равновесии между неупорядоченной конформацией и различными спиралями, имеющими другую форму, чем описанные выше [21].
В трифторэтаноле грамицидин представляет собой мономер [22] , а форма спектра КД больше похожа на спектр грамицидина в мембране [23] , и, таким образом, представляет из себя еще один вид трехмерной структуры грамицидина.

Таким образом, грамицидин существует в различных конформациях, в зависимости от растворителя, и даже в виде набора нескольких конформаций в одном растворителе. Такой полиморфизм можно объяснить похожими энергиями стабилизации различных структур, обусловленных различной сетью водородных связей.

2.4.Структура грамицидина в липидных мембранах и мембрано-подобных средах

Спектр КД встроенного в липидный бислой грамицидина не похож ни на один спектр, полученный в различных органических растворителях [24]. Более того данный спектр нельзя представить как сумму какой либо комбинации спектров растворов грамицидина, и, следовательно, как комбинацию каких-то конформаций обнаруженных в растворах. Форма КД спектра мембрансвязанного грамицидина остается неизменной в широком диапазоне температур. С другой стороны, основываясь на данных только спектров КД нельзя сказать, существует ли грамицидин в какой-то одной форме, или же имеется набор конформеров.
Изученные методом ЯМР 13С и 19F меченые грамицидины, встроенные в липосомы
[25-27] , показали существование одной доминирующей структуры в мембранах.
Спектр КД мембрансвязанного грамицидина в области дальнего ультрафиолета имеет форму похожую на экситонное расщепление, свидетельствующую о стэкинг взаимодействиях триптофанов в данном окружении [28]. Экситонное расщепление так же наблюдается в области ближнего ультрафиолета [18] . что свидетельствует о внутримолекулярных взаимодействиях (Такого экситонного расщепления не наблюдается в растворах, что является еще одним подтверждением разности конформаций в мембране и в растворе). Другие методы
[29, 30] так же подтверждают наличе стэкинг вззаимодействий в мембрансвязанной форме. Данные результаты свидетельствуют о различии в конформации как полипептидного остова, так и в ориентации боковых цепей между мембрансвязанной конформацией и формами, существующими в растворах.
Синхронные исследования флуресценции и проводимости в черных липидных мембранах [31] и в липосомах [32] показывают, что проводящая форма грамицидина является димером. В исследованиях с одиночными каналами (при соотношении грамицидин/липид около 1:10000), регистрация открывания и закрывания канала соотносится с равновесием мономер-димер (Рис.3)

Грамицидин так же образует комплексы с такиими детергентами как лизолецитин
[33] , и додецилсульфат натрия [34]. Исследования таких комплексом методом электронной микроскопии (метод замораживания-скалывания) свидетельствуют о наличии мультиламелярной фазы детергента, в то время как с другими белками и пептидами эти детергенты формируют типичную мицелярную фазу , более того данные 15Р и 2Н ЯМР, а так же дифракции ренгеновских лучей при малом угле демонстрируют, что амфифильные группы молекул детергента имеют бислой- подобную организацию. Этот пример – хорошая демонстрация влияния грамицидина на организацию окружающих его молекул липида [35]
Так как детергент в комплексе с грамицидином оразует мембраноподобные структуры, можно предположить, что трехмерная структура грамицидина в данной системе такая же, как и в бислойных мембранах, хотя другие небольшие пептиды часто имеют различную структуру в мицеллах и в липидных бислоях.
Мембрансвязанная форма грамицидина представляет собой спиральный димер, что было подтвержденно различными химическими и физическими методами. Данные
ЯМР-спектроскопии с использованием 13С и 19F меченных грамицидинов встроенных в липосомы показали наличие структуры в которой N-конец молекулы расположен посередине бислоя , а С-конец ориентирован наружу [25, 26, 27 ].
ЯМР в твердом теле (ориентированные мультиламелярные бислои ) обнаружил такую же структуру [36]. Изучение проводимости аналогов грамицидина в черных липидных мембранах покзали что модифицированные по С-концу аналоги способны образовывать активные каналы только при добавлении их с двух сторон мембраны и не образуют их при добавлении с одной стороны мембраны.
Так как заряженные молекулы не могут переходить с одной стороны мембраны на другую – это явилось еще одним подтверждением того, что мембрансвязанная форма является спиральным димером N-конец к N-концу
В спиральном димере N-конец к N-концу каждый мономер стабилизирован 12-ю внутимолекулярными водородными связями, а димер – 6-ю межмолекулярными водородными связями, в образованиии которых принимают участие N-концевые формильные группы. Предложенно, что открывание и закрывание канала связанно с ассоциацией и диссоциацией ( то есть с образованием и разрывом межмолекулярных водородных связей) такого ддимера [37] (РИС).

Рисунок 3.

Схематическое изображение инактивации грамицидинового канала путем диссоциации димера голова к голове (структура Урри – Арсеньева).

Изучения аналогов грамицидина показали, что N-коцевая формильная группа оказывает сильное влияние на стабильность димера [38]. При ее замещении на более объемную ацетильную [39], сукцинильную [40] или при отсутствии вообще время жизни канала уменьшается. Исследования методом КД-спектроскопии показали сильные конформационные различия между нативным грамицидином и его аналогами, что, возможно является причиной дестабилизации канала [41].
Дальнейшие исследования с помощью 13С- и 15N-меченных аналогов в ориентированных мультиламелярных бислоях показали возможность существования праозакрученной конформации канала [24].

Наиболее детальная структурная конформация грамицидина была определенна методом двумерного ЯМР в комплексе грамицидина с додецилсульфатом натрия
(Арсеньев и сотр. 1985 г.). Данная структура представляет собой спиральный димер, в котором каждая составляющая спираль имеет 6,3 остатка на виток
((6,3-спиральный димер) (Рис.4.)

А Б

Рисунок 4.

СРК Изображение правозакрученного спирального димера грамицидина с 6,3 остатка на виток (PDB Code: 1GRM). A – вид сверху; Б – вид сбоку. Две молекулы грамицидина в димере показанны разными цветами. Водороды скрыты.

. Дальнейшие исследования показали что одна пара остатков Trp (9Trp и 15Trp
) могут находиться в стэкинг взаимодействиях [41]. Более того, теоретические расчеты показали, что наиболее энергетически выгодной структурой в мембране является именно (6,3-спиральный димер, в котором остатки триптофана образуют кластеры на границе раздела фазы липид-вода, и их азоты индoльных групп способны взаимодействовать с полярными головками липидов и с молекулами воды. В двухспиральной конформации остатки триптофана расположенны равномерно по внеешней поверхности спирали и только два из них (в отличие от четырех в (6,3спиральном димере) могут взаимодействовать с молекулами липидов или водой. Таким образом, двухспиральная конформация энергетически дестабилизиированна в мембране по отношению к спиральному димеру [41] (рис.5).

А Б

В

Рисунок 5 Положение боковых радикалов остатков триптофана в различных конформерах грамицидина. Вид сбоку.

Боковые радикалы триптофанов выделенны синим цветом. А – ?6,3- спиральный димер (Структура Урри-Арсеньева, наблюдаемая в мембранах); Б

– ??5,6-двухспиральный димер (Структура Витча, наблюдаемая в органических растворителях); С – ?7,2-двухспиральный димер (структура комплекса грамицидина с ионом цезия в органических растворителях и кристаллах)

Спектроскопические исследования грамицидина в различных мембранах показали, что соотношение спиральных и двухспиральных димеров является функцией степени ненасыщенности липидов, образующих мембрану. При увеличении доли ненасыщенных липидов увеличивается доля двухспиральной конформации. Эти результаты говорят о том, что боковые цепи триптофанов могут взаимодействовать с С=С связями [42]. Модельные исследования в кобинации с экспериметами по изучению липид – пептидных взаимодействий так же подтверждают важность этих аминокислот для стабилизации канальной структуры и оказывают влияние на организацию окружающих грамицидин липидов
[ 17]
В результате (в 90% случаев) грамицидин образуе активный трансмембранный канал одной единственной структуры, являющейся (6,3-спиральным димером. Эта структура аналогична модели предложенной ранее Урри [12].

2.5.Влияние связывания ионов на конформацию грамицидина

Поделитесь этой записью или добавьте в закладки